研究開発

最新技術紹介

研究内容・拠点最新技術紹介学会発表







技術の生命現象を包括的に解析・解明しようというオミックス(-omics)研究が近年盛んに行われています。 解析・測定の対象によってゲノミクス(遺伝子)、プロテオミクス(蛋白質)、メタボロミクス(代謝物)と呼ばれています。

現在、これらさまざまなオミックス解析技術を駆使して研究開発を実施しております。


解析機器

Affymetrix GeneChip System

illumina BeadStation 500GX

Amersham Typhoon9410

Bio-Rad BioPlex System
  • 1. マイクロアレイ(包括的)解析
    - GeneChip®
    - グラスアレイ (Stanford タイプ)


  • 2. ゲノム変異解析
    - SNP アレイ (Mapping アレイ)


  • 3. プロテオーム解析
    - 2D-DIGE (2次元電気泳動)
    - BioPlex (MultiPlex assay)


  • 4. バイオインフォマティクス
    - 数値解析 (GeneSpring GX)
    - SNP解析 (GeneSpring GT)

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マイクロアレイとは、1枚の基板上に数万から数十万の遺伝子断片を異なるスポットとして、高密度に配置し固定したものです。マイクロアレイ上の遺伝子断片に対し、組織や細胞由来のRNA、もしくはRNAから合成したcDNAをハイブリダイズさせることで、組織や細胞の遺伝子発現パターンを、網羅的に解析することができます。


サンプル            コントロール




マイクロアレイ




(※2色法の一例)

抽出

組織や細胞からRNAを抽出します。

標識

サンプル由来RNAとコントロール由来RNAに対して、異なる蛍光物質を標識します(RNAとしてはTotal RNA、もしくは増幅したアンチセンスRNAを用います。Total RNAからは、標識cDNAを合成します)。

競合ハイブリダイゼーション

異なる蛍光物質で標識された、サンプル由来のRNAとコントロール由来のRNAを混合し、マイクロアレイ上で競合ハイブリダイゼーションを行います。

スキャナを用いた検出

ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイ上の蛍光シグナルをスキャナで検出し、イメージ画像を取得します(左図)。

データ解析

イメージ画像のシグナルを数値化して解析することで、数万から数十万の遺伝子について、サンプルとコントロール間の相対的な遺伝子発現量を比較することができます。

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MALDI-TOFMS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−時間飛行型質量分析機)は、サンプルをマトリックスと混合した状態でレーザー光を照射することで、サンプル中のタンパク質をフラグメントに分解することなく本来の質量のままの状態で分析することが可能です。従って、サンプル中に含まれる質量の異なる種々タンパク質の質量パターンを広範囲に知ることができます。この特徴を利用して、血漿タンパク質の質量パターンを比較することにより、患者群と健常者群を分けることができ、これを利用して診断に応用する研究が行われています。

血漿タンパク質からの測定方法は次のとおりです。








●前処理:

イオン交換や疎水性、親水性の官能基を持つカラムやプレートを用いてサンプル中のタンパク質を分画、脱塩します。

前処理したサンプルに対してマトリクッスを混合して専用のプレートに塗布します。




●TOFMS分析:

専用プレートをセットしてレーザーを照射します。サンプル中のタンパク質はイオン化された後、質量の小さい方から検出器へ到達します。

●解析

各サンプルの質量に基づくパターンが得られます。サンプル毎の違いを統計学的に解析し、群間比較を行います。 ○の部分はサンプルによって異なる箇所を示しています。

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反応メカニズム(スギ単独陽性の場合)
酵素法を利用したイムノクロマト法の原理に基づいています。
1.検体(全血、血清、血漿)と検体処理液を混合後、混合液(処理検体)を反応カセットへ滴下
⇒血球の溶解(検体が全血の場合)/特異IgE−ALP*標識抗体複合体の形成   
⇒特異IgE−ALP標識抗体複合体の展開     *:アルカリフォスファターゼ



2.展開液の反応カセットへの滴下
⇒特異IgE−ALP標識抗体複合体の展開加速/固相化発色基質の溶解



3.20分静置
⇒特異IgE−ALP標識抗体複合体の固相化抗原への結合
⇒発色基質の展開


発色
⇒発色基質は固相化抗原ー特異IgE−ALP標識抗体複合体のALPにより不溶化し、
青色のラインとして発色



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Methylation specific PCR法をご説明します。


[Methylation specific PCR法の原理]

DNAをbisulfite 処理するとシトシンはウラシルに変換されますが、メチル化されたシトシン (5'-メチルシトシン)は変換されないことが知られています。
本法は、bisulfite処理後の塩基配列の違いを利用してメチル化の有無をPCRで検出します。

対立遺伝子のメチル化の有無比較

[Sodium bisulfite 処理による塩基の変換]
Sodium bisulfite 処理による塩基の変換の図

[Methylation specific PCR法の白血病診断への応用]

メチル化される遺伝子と疾患
p16遺伝子 各種固形腫瘍
E-カドヘリン 胃癌など
hMLH1 大腸癌、胃癌など
エストロゲンレセプター 大腸癌など
p15遺伝子 MDS、白血病など

参考文献

Takeo Kubota,et al.(1999)Hum Genet 104 :49-55
Clark SJ,et al.(1994)Nucl Acids Res 22 :2990-2997



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